Afinitetna kromatografija je moćna tehnika koja se koristi u biokemiji za pročišćavanje proteina. Uključuje specifično vezanje ciljanog proteina na ligand imobiliziran na čvrstoj podlozi, nakon čega slijedi eluacija proteina u kontroliranim uvjetima. Postoje različite vrste metoda afinitetne kromatografije, od kojih svaka ima svoju jedinstvenu primjenu u pročišćavanju proteina. U ovom ćemo članku istražiti različite vrste afinitetne kromatografije i njihovo značenje u području biokemije i pročišćavanja proteina.
1. Imobilizirana metalna afinitetna kromatografija (IMAC)
IMAC se temelji na specifičnom afinitetu proteina koji sadrže polihistidin (His-tag) za imobilizirane metalne ione, obično nikal ili kobalt. His-označeni proteini vežu se na metalne ione preko koordinacijskih veza, omogućujući selektivno pročišćavanje označenih proteina. IMAC ima širok raspon primjena u pročišćavanju rekombinantnih proteina i proučavanju metaloproteina.
2. Afinitetna kromatografija proteina A/G
Protein A i protein G su bakterijski proteini koji pokazuju visok afinitet za konstantnu regiju imunoglobulina. Ovo se svojstvo iskorištava u pročišćavanju proteina korištenjem imobiliziranog proteina A ili proteina G za hvatanje antitijela iz složenih smjesa. Protein A/G afinitetna kromatografija obično se koristi u pročišćavanju monoklonskih i poliklonskih protutijela, a bitan je korak u proizvodnji terapijskih protutijela.
3. Afinitetna kromatografija s lektinima
Lektini su proteini koji vežu ugljikohidrate koji se mogu koristiti kao ligandi u afinitetnoj kromatografiji za specifično hvatanje glikoproteina ili glikopeptida. Zbog visoke specifičnosti interakcija lektin-ugljikohidrat, lektinska afinitetna kromatografija je vrijedna za izolaciju i pročišćavanje glikoproteina iz složenih bioloških uzoraka. Nalazi primjenu u proučavanju uzoraka glikozilacije i funkcionalnoj karakterizaciji glikoproteina.
4. Imunoafinitetna kromatografija
Imunoafinitetna kromatografija koristi visoku specifičnost i afinitet antitijela za hvatanje i pročišćavanje specifičnih antigena ili ciljnih proteina. Ovaj pristup se široko koristi u izolaciji specifičnih proteina iz bioloških uzoraka, uključujući serum, stanične lizate i supernatante kulture. Imunoafinitetna kromatografija ključna je u istraživanju, dijagnostici i terapijskom pročišćavanju proteina.
5. Afinitetna kromatografija s enzimskim ligandima
Enzimski ligandi, kao što su supstrati, inhibitori ili kofaktori, mogu se koristiti u afinitetnoj kromatografiji za hvatanje i pročišćavanje enzima ili kompleksa enzim-supstrat. Ova metoda omogućuje specifičnu izolaciju ciljnih enzima na temelju njihovih katalitičkih svojstava i interakcija s imobiliziranim ligandima. Afinitetna kromatografija s enzimskim ligandima ključna je za proučavanje kinetike enzima, interakcija enzim-supstrat i pročišćavanje enzima.
Primjena afinitetne kromatografije u pročišćavanju proteina
Svaka vrsta afinitetne kromatografije ima jedinstvenu primjenu u pročišćavanju specifičnih proteina ili klasa proteina. Afinitetna kromatografija naširoko se koristi u raznim područjima biokemije i biotehnologije, uključujući:
- Pročišćavanje rekombinantnih proteina i označenih fuzijskih proteina
- Izolacija antitijela i fragmenata antitijela za istraživanje i dijagnostiku
- Pročišćavanje glikoproteina i glikoziliranih proteina za strukturna i funkcionalna istraživanja
- Izolacija i pročišćavanje enzima visoke specifičnosti i aktivnosti
- Obogaćivanje i pročišćavanje specifičnih antigena i biomolekula za terapeutske primjene
Afinitetna kromatografija revolucionirala je polje pročišćavanja proteina omogućavajući visoko selektivnu i učinkovitu izolaciju ciljnih proteina iz složenih bioloških smjesa. Njegove različite primjene čine ga nezamjenjivim alatom za biokemičare, biotehnologe i istraživače koji rade u području znanosti o proteinima i biofarmaceutici.